Determinarea stafilococului (Aureus)

197

Metoda stabileste prezenta sau absenta unei incarcaturi bacteriene stafilococ (aureus) coagulaza pozitiv in produsele alimentare examinate.

Metoda se aplica urmatoarelor produse:

– Lapte crud

– Lapte praf

– Produse lactate praf pentru copii

– Produse lactate acide (iaurt, smantana fermentata, lapte batut, kefir, sana)

– Iaurt cu fructe

– Smantana dulce pentru frisca si frisca batuta

– Branzeturi proaspete din lapte praf pasteurizat (cas, telemea proaspata)

– Branzeturi proaspete din lapte praf nepasteurizat (cas, telemea proaspata)

– Branza proaspata din zer

– Branza maturata in saramura din lapte pasteurizat

– Branza maturata in saramura din lapte nepasteurizat

– Branza fermentata cu pasta tare (svaiter), semitare (moeciu), moale (Camembert, taga, nasal)

– Branzeturi cu pasta filata (cascavaluri), afumate si neafumate

– Branzeturi fermentate

– Unt

– Margarina de consum

– Margarina cu lapte

– inghetata, torturi de inghetata

– Praf de inghetata

– Lapte concentrat cu zahar

– creme vegetala (inlocuitori de frisca)

– Carne tocata si semipreparate din carne tocata (hamburger, pasta de mititei, carnati proaspeti etc.)

– Preparate din carne sarate si/sau afumate

– Mezeluri (prospaturi, salamuri semiafumate)

– Mancaruri gatite congelate si mancaruri gatite, servite calde

– Preparate din carne, mixte sau simple, gata pregatite, care se consuma reci, fara alta prelucrare (piftii, pateuri din carne si organe, biftec)

– Produse crude (snitel, cascavas pane)

– Peste proaspat, decapitat si eviscerat

– Produse semiconservate (marinate reci, marinate calde nepasteurizate, marinate calde pasteurizate, produse din icre si din lapti)

– Icre sarate

– Salata de icre cu adaos de ulei

– Peste sarat

– Peste sarat cu ceapa

– Peste afumat la cald, peste afumat la rece

– Preparate culinare din peste

– Oua umplute, salate cu maioneza

– Gelatina alimentara

– Prajituri cu crema

– Torturi cu diferite creme, frisca, fructe

– Maioneza

– Pulberi de maioneza (inlocuitori de maioneza)

– Vegetale congelate

– Vegetale deshidratate

– Prafuri de budinci si creme deshidratate, inlocuitori de frisca

– Paste fainoase (macaroane, fidea)

– Paste fainoase cu umplutura (ciuperci, carne branza)

– Condimente si amestecuri

– Bauturi racoritoare si sucuri de fructe cu termen de valabilitate mai mic de 14 zile

– Pulberi pentru sucuri

– Ape minerale si carbogazoase, ghiata artificiala

– Bere nepasteurizata, filtrata si nefiltrata

– Bere pasteurizata

– Fainuri alimentare altele decat fainuri pentru panificatie (faina de orez, orezin, fosfarin)

– Produse de panificatie cu umpluturi

– Derivate din cereale tratate termic (fulgi de porumb, orez, produse expandate)

– Biscuiti uscati si biscuiti glazurati

– Biscuiti, pateuri

– Fursecuri, napolitane cu diferite creme

– Cacao, pudra, ciocolata tablete, ciocolata cu adaos, bomboane fine si extrafine de ciocolata

– Ciocolata umpluta cu crema

– Specialitati din ciocolata umplute cu crema grasa sau de tip fondant

– Bomboane altele decat ciocolata

– Jeleuri, rahat, gemuri, serbeturi, dulceturi, fructe confiate

– Arome alimentare naturale sau sintetice

– Emulsie pentru bauturi racoritoare

– Concentrate alimentare (supe, cuburi de carne)

– Otet alimentar

– Ceai (planta)

– Bors

– Cafea cruda prajita si instant

– Melanj din oua praf

– Produse din grau germinat

– Fructe de mare refrigerate

– Pepsina (pulbere in maestec cu sare)

– sandviciuri, mancaruri tip fast-food

Documente de referinta

STAS-uri folosite pentru produsele enumerate la punctul anterior sunt urmatoarele:

– ISO 17025/2001

– ISO 5541/1 – 1986 (pentru produse lactate si derivate)

– STAS 6349/4 – 1980 (pentru produse lactate)

– ISO 707

– ISO 8261 (pentru lapte si produse lactate)

– ISO 4832 – 1992 (pentru produse carnate)

– STAS 2356 – 1982 (pentru produse carnate)

– SR ISO 6887/96

– STAS 11499 – 1981 (pentru produse zaharoase)

– SR ISO 8924 – 1995 (pentru recipiente inchise)

Principiul metodei

  • insamantare in suprafata unui mediu selectiv solid, turnat in doua serii de placi Petri cu o cantitate determinata din esantionul de analizat daca produsul este lichid sau din suspensia mama in cazul altor produse. in aceleasi conditii se insamanteaza si dilutiile decimale obtinute din esantionul de analizat sau din suspensia mama in prealabil insamantate intr-un mediu de imbogatire (chapman lichid);
  • Incubarea acestor placi timp de 24 – 48 de h la 35oC sau 37oC;
  • Calculul numarului de stafilococcus aureus pe ml sau pe gram de esantion pornind de la numarul de colonii caracteristice si/sau necaracteristice care se obtin in placile alese, la nivelurile de dilutie care dau rezultate semnificative si care se confirma prin proba coagulazei.

SOLUTII DE DILUARE SI MEDII DE CULTURA

Solutii de diluare de utilizare generala

Solutie salina sterila

Repartizarea, sterilizarea si pastrarea solutiilor de diluare – se repartizeaza solutiile de diluare pentru dilutiile initiale in flacoane sau sticle iar pentru dilutiie urmatoare in eprubete sau sticle. Cantitatile trebuie astfel repartizate, astfel incat dupa sterilizare fiecare flacon sau sticla sa contina 90 ml solutie de diluare sau un multiplu de 9 ml. Eprubetele, flacoanele sau sticlele trebuie inchise cu dopuri. Sterilizarea trebuie facuta in autoclav la 121+-1oC timp de 15 minute (un timp mai lung poate fi necesar pentru volume mai mari). Daca solutiile de diluare nu sunt folosite imediat, ele trebuie pastrate la intuneric intre 0-5oC maxim o luna pentru evitarea oricarei modificari a volumului sau compozitiei lor.

Medii de cultura

  • Bulion hipersalin cu manita si indicator (chapman lichid)
  • Agar hipersalin cu manita si indicator (chapman solid)
  • Plasma citratata de om sau de iepure
  • Bulion de inima de creier

Aparatura si sticlarie pentru sterilizarea cu caldura uscata sau cu caldura umeda (ISO 7218)

  • Termostat 35oC; 37o +0,5oC – aparat electric pentru dezvoltarea microbiana
  • Etuva 160 – 180oC – asigura sterilizarea cu caldura uscata a obiectelor de sticla, portelan, hartie, vata, instrumente metalice la temperatura de 180oC timp de 30-60 minute
  • Autoclav – realizeaza sterilizarea prin incalzire cu vapori prin presiune pentru: medii de cultura, produse patologice obiecte de cauciuc. Temperatura este de 121oC timp de 20-30 minute
  • Lampa U.V. – radiatii U.V. cu efect bactericid pentru sterilizarea aerului incaperilor si a suprafetelor de lucru
  • Balanta analitica – balanta electronica cureglare automata functie de temperatura camerei
  • Sterilizator electric pentru instrumente
  • Baie de apa reglabila sau echipament similar reglabil la 45+0,5oC
  • Baie de apa reglabila sau echipament similar reglabil la 50+0,5oC
  • Cutii Petri sterile din material plastic cu diametrul de 90-100 mm
  • Pipete gradate sterile de 1 ml+ 0,02 ml sau de 10 ml + 0,2 ml
  • Baghete de etalare din sticla (tip crosa de hochei) cu diametrul de 3,5 ml si lungimea de 20 cm indoite in unghi drept la cca 3 cm de una din extremitati, extremitatile taiate trebuie sa fie rotunjite la cald, sterile.
  • pH metru cu compensare de temperatura cu exactitate 0,1 unitati de pH la 25o C
  • Eprubete de 18/180 mm si flacoane pentru cultura cu capacitatea de 125-300 ml pentru sterilizarea si pastrarea mediilor de cultura
  • Eprubete cu diametrul de 10 ml x 75 ml necesare pentru determinarea coagulazei
  • Pipete cu scurgere totala cu capacitate nominala de 1 ml si 10 ml
  • Mojar cu pistil, steril
  • Perle de sticla cu diametrul de cca 6 mm
  • Flacoane cu capacitatea de 90, 150 si 250 ml
  • Pipete etalonate special pentru uz bacteriologic cu capacitate nominala de 1 ml cu diviziuni de 0,1 ml si al caror orificiu de scurgere are un diametru de 2-3 ml
  • Etuva sau incubator ventilat (a) (care permite uscarea mediului gelozat turnat in placi) reglabil(a) la 50+1oC

ESANTIONARE

Esantionarea se efectueaza conform standardului specific al produsului de analizat. Daca nu exista standard specific se recomanda ca partile interesate sa se puna de acord asupra acestui subiect.

Esantioanele sunt etichetate, cuprinzand: produsul recoltat, examenul cerut, locul prelevarii, ziua si data prelevarii, data de valabilitate, sigiliul, martorii prelevarii, cine a prelevat.

Esantionul se pregateste conform standardului international specific al produsului respective:

  • Lapte crud si produse lactate – se agita energic esantionul de analizat pentru a asigura o repartizare uniforma a microorganismelor rasturnand rapid de 25 de ori recipientul cu esantion. Trebuie evitata formarea spumei iar cea formata trebuie dispersata. Intervalul dintre omogenizarea esantionului si prelevarea probei necesare analizei nu trebuie sa depaseasca 3 minute;
  • Lapte praf, zer dulce si lactoza – se amesteca direct continutul recipientului inchis, prin agitari si rasturnari repetate..Se cantaresc 10 g esantion intr-un vas de sticla si se rastoarna praful in sticla cu solutia de diluare (90 ml de solutie adecvata la 45+1oC in baie de apa). Se mentin flacoanele in baia de apa timp de 5 minute agitand din cand in cand. Se obtine astfel o dilutie de 10-1;
  • Branza si branza topita – se folosesc 10 g proba intr-o capsula cu o cantitate mica de solutie de diluare si se omogenizeaza cu pistilul. Se adauga restul de diluare pana la intregul volum de 90 ml solutie de diluare. Se obtine astfel dilutia 10-1;
  • Untul – se pune recipientul cu esantion intr-o baie de apa la 45oC. Se agita pentru a usura topirea si se mentine pana la topirea completa. Se agita si cu o pipeta incalzita la cca 45oC se introduc 10 ml intr-un flacon care contine 90 ml solutie de dilutie. Se agita de fiecare data inaintea transferului urmator. Se obtine dilutie de 10-1. Pentru obtinerea dilutiilor se poate lucra alternativ numai cu faza apoasa;
  • Alimentele cu consistenta semisolida se omogenizeaza ca atare;
  • Alimentele cu consistenta solida se marunteste in bucati mici inainte de mojarare. Din proba de analizat se introduc in mojar 1g/10g + cantitatea egala de nisip steril. Se tritureaza adaugandu-se treptat lichid de dilutie de 9 ori mai mare decat esantionul.

Actiuni si/sau masuri preventive

Pentru a obtine o cultura pura de germeni este necesar ca materialul de laborator folosit (recipiente, instrumente, sticlarii) sa fie steril. Sticlaria intrebuintata este sterilizata la etuva la 180oC timp de 30 minute, iar mediile sterilizate la 121oC timp de 30 minute.

Pregatirea materialului de sterilizat:

– Spalarea sticlariei cu apa cu detergent, apoi limpezirea la jet continuu de apa, dupa care spalarea cu apa distilata;

– Punerea de dopuri de vata cu tifon, invelirea cu hartie a gatului eprubetelor sau baloanelor;

– Introducerea in etuva pentru 30 de minute la 121oC.

Protectia personalului: Obligatorie purtarea halatului, Folosirea lampei de U.V. (inainte si dupa insamantare), Folosirea hotei de insamantare

Metodologia de lucru

  • Insamantare si incubare

Din produsul omogenizat si din fiecare dilutie se insamanteaza cate 1 ml in cate o eprubeta cu 10 ml chapman lichid.in cazul celorlalte produse din suspensia mama se insamanteaza cate 10 ml in cate o eprubeta cu 10 ml chapman lichid.

Se incubeaza eprubetele insamantate cu mediu de imbogatire timp de 24 – 48 h la temperatura de 35o 37oC.

Din fiecare eprubeta in care au aparut semne de dezvoltare microbiena prin virarea culorii mediului de imbogatire se fac treceri pe suprafata unui mediu selectiv (chapman solid) turnat in placi Petri sterile prin strierea cu ajutorul unei anse de insamantare.

Placile Petri astfel insamantate se incubeaza la 35o 37oC timp de 24 – 48 h.

  • Interpretarea

Se controleaza placile Petri insamantate si din cele unde s-au dezvoltat colonii caracteristice si/sau necaracteristice, se retin placile care contin intre 15 si 150 colonii caracteristice si/sau necaracteristice. Din fiecare placa Petri se aleg pentru confirmare cate 5 colonii caracteristice si/sau necaracteristice dupa caz.

  • Test de confirmare (proba coagulazei)

Cu ajutorul unei anse bacteriologice sterile se preleveaza o parte din fiecare colonie selectionata si se insamanteaza intr-o eprubeta cu bulion de inima creier. Se incubeaza la 35o sau 37oC timp de 20 – 24 h. Se adauga in mod steril cate 0,1 ml din fiecare cultura la cate 0,3 ml plasma de iepure in eprubete sterile cu diametru de 10 x 75 ml si se incubeaza la 35o sau 37oC. Se examineaza coagularea plasmei dupa 4 – 6 h.

Se considera ca reactia coagulazei este pozitiva cand coagulul ocupa mai mult de trei patrimi din volumul ocupat initial de lichid.

Pentru control se adauga 0,1 ml bulion de inima creier steril la cantitatea recomandata de plasma de iepure (0,3ml) si se incubeaza fara insamantare.

Pentru ca reactia sa fie valabila plasma din eprubeta martor nu trebuie sa prezinte semne de coagulare.

  • Calculul

Daca cel putin 80% din coloniile selectionate sunt coagulaza pozitiv se ia ca numar de stafilococcus (aureus) numarul prezumtiv dat de numaratoarea facuta conform punctului 10.5.

in toate celelalte cazuri numarul se calculeaza pornind de la numarul de stafilococcus aureus prezumtiv (punctul 10.5.) care sunt coagulaza pozitiv (punctul 10.6.).

Cutiile care contin intre 15 si 150 colonii caracteristice si/sau necaracteristice pentru doua dilutii consecutive numarul de stafilococcus aureus pentru fiecare dilutie se calculeaza asa cum se indica la punctul 10.7.1. si 10.7.2. si se face media aritmetica a celor doua valori obtinute exceptand cazul cand raportul dintre valoarea cea mai mare si valoarea cea mai mica este peste 2; in acest caz se retine ca rezultat valoarea cea mai mica.

EXPRIMAREA REZULTATELOR

Cu rezultatele obtinute in cele doua serii de cutii sau cu cele doua dilutii consecutive se calculeaza numarul mediu de stafilococcus aureus.Se aduna mediile de stafilococcus aureus obtinute din coloniile caracteristice si/sau necaracteristice, luand in considerare pentru fiecare factorul de dilutie.

Nu se retin decat doua cifre semnificative procedand dupa cum urmeaza:

– daca numarul este mai mic de 100 se rotunjeste la cel mai apropiat multiplu de 5

– daca numarul este mai mare de 100 si se termina cu 5, se rotunjeste la cel mai apropiat multiplu de 20

– daca numarul este mai mare de 100 si nu se termina cu 5, se rotunjeste la cel mai apropiat multiplu 10

Pentru a se obtine numarul de stafilococcus aureus pe gram de produs dupa caz se multiplica aceasta valoare cu inversul volumului inoculului si apoi cu inversul ratei de dilutie a esantionului de analizat

Rezultatul se exprima printr-un numar cuprins intre 1,0 si 9,9 multiplicat cu 10n, unde n este puterea corespunzatoare.

Pentru estimarea numerelor mici se face o medie din numarul coloniilor confirmate caracteristice si necaracteristice si se rotunjeste la numarul intreg urmator cel mai apropiat.

Daca pentru cutiile insamantate cu esantion de analizat ( produs lichid) sau suspensie mama (alte produse) numarul mediu al coloniilor confirmate calculat conform punctului 11.1. este mai mic de 15 rezultatul se da sub forma

a) pentru prdusele lichide

– mai putin de 15 x ne Stafilococcus aureus pe ml, unde ne este inversul volumului de inocul:

ne = ______1_______

: Volum de inocul

b) pentru celelalte produse:

– mai putin de 15 x Ne Stafilococcus aureus pe gram unde

Ne= _____1_______ x ____________1___________

Volum de inocul dilutia esantionului de analizat

c) pentru estimarea numerelor mici in produsele lichide:

m x ne Stafilococcus aureus pe ml unde m este numarul de colonii confirmate

d) pentru estimarea numerelor mici in celelalte produse:

m x Ne Stafilococcus aureus pe gram unde m este numarul mediu de colonii comfirmate.

LĂSAȚI UN MESAJ

Please enter your comment!
Please enter your name here